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Resumen
El cáncer de páncreas es particularmente refractario a las terapias modernas, con una tasa de supervivencia a 5 años para pacientes con un pésimo 8%. Una de las barreras importantes para un tratamiento efectivo es el microambiente del tumor pancreático inmunosupresor y el desarrollo de resistencia al tratamiento. Se necesitan urgentemente nuevas opciones de tratamiento para aumentar tanto la supervivencia como la calidad de vida de los pacientes. Este estudio informa sobre un nuevo derivado de cannabis no cannabinoide, no psicoactivo, denominado FBL-03G, con el potencial de tratar el cáncer de páncreas. Los resultados in vitro muestran un aumento importante en la apoptosis y una disminución consecuente en la supervivencia de dos modelos de cáncer de páncreas: células de cáncer de páncreas Panc-02 y KPC tratadas con concentraciones variables de FBL-03G y radioterapia. Mientras tanto, los resultados in vivo demuestran la eficacia terapéutica para retrasar la progresión tumoral local y metastásica en modelos animales con cáncer de páncreas cuando se usa FBL-03G administrado de forma sostenible a partir de biomateriales de radioterapia inteligente. Los experimentos repetidos también mostraron un aumento significativo (P <0,0001) en la supervivencia de los animales con cáncer de páncreas en comparación con las cohortes de control. Los hallazgos demuestran el potencial de este nuevo derivado del cannabis en el tratamiento del cáncer de páncreas localizado y avanzado, lo que proporciona ímpetu para futuros estudios hacia la traducción clínica.
introducción
El adenocarcinoma ductal pancreático es una enfermedad intranecina antagonista del páncreas exocrino con <8% de pacientes que sobreviven dentro de un período de 5 años (1, 2). Un desafío importante compartido por los cánceres pancreáticos es su agresividad, que a menudo hace metástasis a otros órganos incluso antes de que el paciente sea diagnosticado (3, 4).
Las opciones de tratamiento actuales para el cáncer de páncreas incluyen: cirugía, quimioterapia, terapia dirigida, inmunoterapia y radioterapia. El tratamiento curativo está disponible solo si el tumor se encuentra temprano y se puede extirpar mediante cirugía antes de la metástasis. Si el cáncer ha hecho metástasis, el estándar de atención es la quimioterapia o la radioterapia. Sin embargo, el cáncer de páncreas es notablemente desafiante para las terapias actuales, incluidas la quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia (1, 5).
Los cannabinoides, que son los componentes bioactivos de Cannabis sativa y sus derivados, se han investigado como agentes anticancerígenos y para controlar los efectos secundarios de los tratamientos convencionales contra el cáncer como la quimioterapia y la radioterapia (6). Estudios anteriores han indicado que los derivados de cannabis medicinal podrían mejorar la supervivencia en modelos animales con cáncer de páncreas, cuando se usan en sinergia con la radioterapia (7). También se han investigado materiales inteligentes para la administración de medicamentos, como el sistema de biomateriales de radioterapia inteligente (SRB) para administrar cannabinoides en tumores para mejorar el tratamiento de radioterapia para el cáncer de páncreas (8). Un beneficio importante del enfoque SRB es su capacidad de ser empleado en lugar de los biomateriales de radioterapia inerte utilizados actualmente (por ejemplo, espaciadores o marcadores fiduciales) y, por lo tanto, su uso podría no presentar inconvenientes adicionales para los pacientes.
En este estudio, investigamos un nuevo derivado no cannabinoide, no psicoactivo del cannabis, llamado FBL-03G, para evaluar su potencial para el tratamiento del cáncer de páncreas. Presumimos que el uso de FBL-03G tendrá potencial terapéutico y puede mejorar la radioterapia durante el tratamiento del cáncer de páncreas. Para investigar esta hipótesis, los estudios in vitro se realizaron primero con y sin radioterapia (RT). Los estudios in vitro, también se realizaron estudios in vivo en pequeños animales que emplean FBL-03G administrado de manera sostenible a partir de biomateriales de radioterapia inteligentes, lo que permite la exposición continua del tumor a las cargas útiles de derivados de cannabis a lo largo del tiempo.
Además de las propiedades antineoplásicas de los derivados del cannabis, las propiedades moduladoras del sistema inmunitario de estos extractos han sido bien documentadas (8-12). También se investigaron diferentes volúmenes y concentraciones de cargas útiles de FBL-03G por su potencial para generar respuestas tumorales sistémicas. En particular, investigamos el efecto abscopal, por el cual la radioterapia (RT) en un sitio puede conducir a la regresión del cáncer metastásico en sitios distantes que no están irradiados (13). El efecto abscopal se ha relacionado con mecanismos que afectan al sistema inmunitario (14). Sin embargo, el efecto abscopal es raro porque en el momento del tratamiento, los mecanismos de tolerancia inmune establecidos pueden dificultar el desarrollo de respuestas abscopales suficientemente robustas. Hoy en día, el consenso cada vez mayor es que la combinación de radioterapia con inmunoadyuvantes brinda la oportunidad de aumentar las tasas de respuesta abscopal, extendiendo el uso de radioterapia al tratamiento de la enfermedad local y metastásica (15). En este contexto, el derivado de cannabis FBL-03G también se investigó como un posible inmunoadyuvante a la radioterapia.
Materiales y métodos
Se adquirieron acetona, dimetilsulfóxido (DMSO), ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) (PM: 50-50 kDa) y colorante CrystalViolet de Sigma-Aldrich. El aparato de Harvard se obtuvo de Harvard Bioscience (Holliston, MA, EE. UU.), Y el tubo de silicona (ID 1/32 “) se adquirió de la División de Laboratorios de Plásticos de Saint-Gobain Performance (EE. UU.). Las agujas de braquiterapia se compraron de IZI Medical Products (MD, EE. UU.). Todos los productos de cultivo celular (DMEM, RPMI, tripsina, suero bovino fetal, aminoácidos no esenciales MEM, piruvato de sodio, β-mercaptoetanol, penicilina / estreptomicina y PBS pH 7.4) se obtuvieron de Gibco, Thermo Fisher y Life Technologies ( Waltham, MA, EE. UU.). FlavocureBiotech Inc. (Baltimore, MD, EE. UU.) Suministró la molécula de prueba, FBL-03G con una pureza del 98,7% determinada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Síntesis FBL-03G
FBL-03G, un flavonoide derivado de Cannabis sativa L., es el isómero antinatural de Cannflavin B, un metabolito de Cannabis. Mediante un enfoque de aislamiento guiado por bioactividad, se aislaron 11 flavonoides mediante cromatografía flash y se caracterizaron por métodos de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas (EM) (2, 16, 17). Los datos espectroscópicos generados para FBL-03G fueron similares a los de los siguientes 11 compuestos previamente aislados y caracterizados de la planta de Cannabis; apigenina (1), crisoeriol (2), kaempferol (3), luteolina (4), quercetina (5), vitexina (6), isovitexina (7), orientina (8) y flavonoides prenilados que incluyen Cannflavin A (9), Cannflavin B (10) y Cannflavin C (11) (Figura S1) (16–21). Las moléculas se seleccionaron adicionalmente para la inhibición de la quinasa, y el crisoeriol (Cresorol) demostró una actividad significativa contra FLT3, FLT3-ITD y FLT3-D835Y y una actividad moderada contra CSF1R (2). FBL-03G demostró actividad significativa contra CSF1R quinasa y actividad moderada contra FLT3, FLT3-ITD, FLT3-D835Y, CK2a, CK2a2, Aurora A, Aurora B, Aurora C y Pim2 (2). Fabricación de biomateriales de radioterapia inteligente (SRB)
Este estudio utilizó el tratamiento combinado de FBL-03G (Mw = 368.38 g / mol) como inmunoadyuvante, administrado a partir de biomaterial de radioterapia inteligente (SRB) y radioterapia (RT). Los SRB se desarrollaron siguiendo procedimientos previamente informados para fabricar y cargar medicamentos en los SRB. Brevemente, 300 mg de polímero de ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) añadido a 3,5 ml de acetona se mezclaron homogéneamente en un hidrogel (8, 22). El aparato de Harvard se usó para proporcionar un caudal constante de la mezcla en el tubo de silicio con un diámetro interno de 1/32 ‘. El hidrogel PLGA cargado en un tubo de silicio se dejó curar por debajo de 50 ° C durante 48 h. Después del curado, el tubo de silicio se cortó a una longitud de 5 mm y se extrajeron los SRB. Se utilizaron tres concentraciones diferentes de FBL-03G, respectivamente, como cargas útiles en los SRB. Se usó una plataforma de investigación de radiación de animales pequeños (SARRP, Xtrahl, Inc., Suwanee, GA, EE. UU.) Para radioterapia utilizando 220 kVp, 13 mA, boquilla (10 × 10) mm y filtro de cobre (Cu) de 0,15 mm para suministrar 6 dosis gris (Gy). Además, se tomaron imágenes de tomografía computarizada (TC) de los ratones con 65 kVp y 0,8 mA. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se usó radioterapia guiada por imagen para irradiar tumores específicamente en un sitio según sea necesario.
Cultivo de células
La línea celular de cáncer de páncreas, Panc-02, se obtuvo del Instituto Nacional del Cáncer y se cultivó con Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. Otra línea celular de cáncer de páncreas, las células Ptf1 / p48-Cre (KPC) fueron un regalo del Dr. AnirbanMaitra (Centro de Cáncer MD Anderson). La línea celular KPC se derivó de un LSL-Kras; p53 + / floxed, ratón Pdx-cre. Las células KPC se cultivaron en medio RPMI suplementado con 10% de FBS, 2 mmol / L de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de aminoácidos MEM no esenciales, 1 mmol / L de piruvato de sodio y 0.1 mmol / L de β- mercaptoetanol Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
Ensayo de supervivencia clonogénica.
Las monocapas en crecimiento activo de células cancerosas KPC y Panc-02 se tripsinizaron y se sembraron 300 células por pocillo en placas de 6 pocillos. 24 horas después, las células sembradas se trataron con 0, 1, 2 o 4 μM de concentraciones de FBL-03G por pocillo. Las células se irradiaron a 0, 2 o 4 Gy usando energía de 220 kVp, 13 mA, 24 h después del tratamiento con FBL-03G. Se utilizó una plataforma de investigación de radiación de animales pequeños (SARRP) para administrar radiación de haz externo. Las colonias en crecimiento (≥ 50 células / colonia) se fijaron con etanol al 75% y se tiñeron con violeta cristal al 1% 9-12 días después del tratamiento. Las colonias se contaron usando el software ImageJ y se calculó un porcentaje de supervivencia siguiendo el protocolo estándar.
Ratones y generación de modelos singénicos de cáncer pancreático
Se adquirieron ratones macho y hembra de la cepa C57BL / 6 de tipo salvaje de TaconicBiosciences, Inc. a las 8 semanas de edad. Los experimentos con animales siguieron las pautas y regulaciones establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto del Cáncer Dana-Farber (IACUC). El mantenimiento de los ratones en las instalaciones de animales del Dana-Farber CancerInstitute se realizó de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Todos los tratamientos se administraron directamente a un tumor mediante inyección intratumoral directa o mediante implantación intratumoral de SRB cargada para la liberación sostenida. Para las cohortes tratadas en conjunto con radioterapia, se utilizó una plataforma de Investigación en Radiación de Pequeños Animales (SARRP) para la radioterapia guiada por imágenes a 220 kVp y 13 mA. El diseño del estudio incluyó un proceso de aleatorización de los ratones seguido de una selección en las siguientes cohortes de: sin tratamiento, dosis de RT de 6 Gy, FBL-03G con / sin 6Gy y SRB cargado con FBL-03G y con / sin 6Gy. Todos los ratones que recibieron tratamiento con FBL-03G en el primer y segundo ensayo fueron tratados con 100 μg de inmunoadyuvante FBL-03G. Se utilizó la misma cantidad de carga útil en los SRB que con otras rutas de administración. Se administraron SRB en los tumores correctos utilizando una aguja de braquiterapia clínica de calibre 17.
Que el cannabis es eficiente contra el cáncer porque el THC y el CBD tienen efectos apoptóticos y angiogénicos en las masas tumorales ya sabemos. Hay aproximadamente 700 publicaciones que aparecen en el portal de PubMed cuando buscamos esas dos palabras clave. Aunque estamos lejos de entender los mecanismos a través de los cuales estos cannabinoides actúan específicamente, y a pesar de que hay decenas de otros cannabinoides todavía poco estudiados, hoy la ciencia empieza a analizar con más atención a otros compuestos del cannabis que no son cannabinoides. Flavonoides y terpenoides son los más comunes.
Es el caso del estudio publicado en Julio de 2019 en la sección radiológica del jornal “Fronteras en Oncología” indexado en el portal NCBI, de autoría de científicos de universidades mixtas como Harvard, Massachusetts, yBaltimore.
Pruebas in vitro evidenciaron el efecto apoptótico del flavonoide cannábico denominado FBL-03G en la masa tumoral pancreática, mientras estudios in vivo demuestran la eficacia terapéutica para retrasar la progresión tumoral local y metastásica en modelos animales con cáncer de páncreas, que tuvieron mayores tasas de supervivencia.
Articulo Original publicado en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6663976/
Se utilizó dimetilsulfóxido (DMSO) como disolvente para disolver el polvo FBL-03G. Para investigar el potencial de FBL-03G como inmunoterapia, se consideraron diferentes concentraciones de FBL-03G en una cantidad de 100, 200 y 300 μg. Se siguió el mismo procedimiento de carga de medicamentos en los SRB que el primer y el segundo ensayo. Se midieron los volúmenes tumorales para ambos tumores el día del tratamiento y al menos 1–2 veces / semana después del tratamiento. También se realizó un estudio de supervivencia. Los ratones fueron sacrificados cuando cualquiera de los tumores excedía de 20 mm de diámetro colectivamente y / o cuando los tumores se ulceraban o se rompían. Se creó una cohorte de control sin tratamiento de FBL-03G pero con una inoculación de DMSO.
En 3 estudios con animales independientes, los ratones se aleatorizaron y se dividieron en algunas de las siguientes cohortes de: sin tratamiento, 6 Gy, FBL-03G con / sin 6Gy y SRB cargado con / sin FBL-03G y con / sin 6Gy. Los ratones inoculados con tratamiento con FBL-03G recibieron 100, 200 o 300 ug de FBL-03G. Se utilizó una carga útil de la misma cantidad de FBL-03G en SRB que con otras rutas de administración.
Evaluación del volumen tumoral
Directamente después del tratamiento, se usó un calibrador Vernier digital para medir la longitud y el ancho de los tumores dérmicos. Fórmula del volumen tumoral utilizada: (largo × ancho2) / 2. La longitud imaginaria de la pierna se eligió como longitud y la vertical fue para el ancho. Los tumores fueron retenidos entre las capas superficiales de la piel. El volumen del tumor se trazó contra el tiempo. La supervivencia de los animales se realizó para los tratamientos siguiendo el protocolo aprobado por IACUC, que se predeterminó en base a la evidencia publicada que justifica dicho diseño de estudio. El logro tumoral> 1 cm de diámetro en ambos flancos o la explosión tumoral se determinó como una carga tumoral excesiva y el ratón se sacrificó siguiendo el protocolo.
Análisis estadístico
Los experimentos in vitro se realizaron por triplicado y los datos se presentaron como media ± error estándar o en la forma cuantificada de otra manera. El volumen tumoral de los ratones se analizó usando la prueba t de dos colas de Student estándar. La supervivencia de los ratones se analizó usando GraphPadPrism 8.0. Un valor p de * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 y **** P <0.0001 se consideraron como una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
La Figura 1 ilustra el enfoque de la terapia utilizando FBL-03G cargado en biomateriales de radioterapia inteligente (SRB) para el suministro sostenido a las células tumorales. Antes de los estudios in vivo con el FBL-03G, se realizaron estudios in vitro con exposición sostenida de células cancerosas con FBL-03G. Se realizó un ensayo clonogénico para identificar el efecto anticancerígeno del fármaco FBL-03G con y sin radioterapia en 2 líneas celulares de cáncer de páncreas, KPC y Panc-02. La Figura 2 destaca la muerte de células tumorales mejorada para el tratamiento combinado de FBL-03G y radiación en comparación con los tratamientos individuales solos. Los resultados de supervivencia clonogénica muestran que el uso de 1 μM de FBL-03G tiene un efecto sinérgico en las células pancreáticas con exposición a 4 Gy de radioterapia en términos de disminución de la proliferación de células de cáncer de páncreas. Estos hallazgos se observaron para las líneas celulares de cáncer pancreático Panc-02 y KPC. Esto demuestra potencial terapéutico para el FBL-03G. Además, el uso de 4 μM de FBL-03G fue aparentemente más efectivo para matar las células de cáncer de páncreas que 4 Gy de radioterapia. Esto sugiere que FBL-03G puede inducir apoptosis e inhibir la proliferación de células cancerosas con concentraciones de fármaco optimizadas. El efecto FBL-03G sobre las células cancerosas combinado con el daño del ADN de la radioterapia podría explicar los resultados sinérgicos observados.
El uso de biomateriales de radioterapia inteligentes para el suministro prolongado de FBL-03G a los tumores también puede aumentar la muerte celular maligna in vivo con FBL-03G. El diseño del estudio in vivo se ilustra en la Figura 3. Los resultados se muestran en la Figura 4. Las Figuras 4A-D muestran una distinción entre la inyección intratumoral directa de FBL-03G frente al uso de la misma concentración de FBL-03G con el dispositivo inteligente. plataforma biomaterial de radioterapia. Las Figuras 4C, D muestran la reducción del crecimiento tumoral en las cohortes de animales tratadas con FBL-03G cargado en SRB en comparación con las cohortes tratadas con la administración directa de la misma dosis de FBL-03G que se muestra en las Figuras 4A, B frente a las cohortes de control e irradiadas. Sorprendentemente, los resultados en la Figura 4D revelaron que los tumores cercanos no tratados (abscopal), que representan metástasis, también se vieron significativamente afectados con el crecimiento tumoral más lento. Los experimentos repetidos mostraron un aumento significativo en la supervivencia de los ratones (Figuras 4E, F) en comparación con las cohortes de control. Los resultados proporcionan una base para futuros estudios para optimizar diferentes parámetros para obtener resultados máximos a través de este enfoque.
En otro estudio evaluamos el efecto de FBL-03G usando 3 concentraciones diferentes (100, 200 y 300 ug) cargadas en biomateriales de radioterapia inteligente con / sin radioterapia. Los hallazgos en la Figura 5 no muestran diferencias significativas en el volumen del tumor entre el uso de biomateriales de radioterapia inteligentes con FBL-03G solo versus el uso de SRB con cargas útiles de FBL-03G en combinación con radioterapia. Sin embargo, se observa una diferencia significativa entre las cohortes 6Gy y control versus la combinación de FBL-03G en los grupos tratados con SRB en las Figuras 5A, B, donde el crecimiento tumoral de los tumores tratados y no tratados se inhibe en comparación con las cohortes control y 6Gy. En general, los datos demuestran un potencial terapéutico significativo para usar FBL-03G en el tratamiento de la enfermedad local y metastásica, aumentando significativamente la supervivencia (Figura 5C).
Discusión
A partir de los resultados de este estudio, los hallazgos clave incluyen la observación de que un derivado no cannabinoide del cannabis puede mejorar los resultados del tratamiento de radioterapia in vitro e in vivo como se destaca en las Figuras 2, 4.4. En segundo lugar, el suministro sostenido del derivado de cannabis FBL-03G a partir de biomateriales de radioterapia inteligentes (SRB) da como resultado la inhibición del crecimiento tumoral de tumores tratados localmente y no tratados a distancia, con y sin radioterapia. El uso de biomateriales de radioterapia inteligente (SRB) (8, 23) se propuso recientemente como un enfoque novedoso para administrar cannabinoides, lo que permite una exposición prolongada de las células tumorales a estos derivados del cannabis, que se espera que sea más eficaz (10). La carga útil de FBL-03G utilizada en este estudio es un derivado flavonoide no cannabinoide del cannabis, y el potencial para inhibir la progresión tumoral local y metastásica es notable, especialmente para el cáncer de páncreas, con una tasa de supervivencia a 5 años de 8% ( 1)
Si bien se están realizando estudios en curso para abordar el mecanismo específico para este potencial de inmunoterapia de este derivado del cannabis, la posibilidad de aprovechar dicho enfoque terapéutico para tratar la metástasis o aumentar la supervivencia es significativa, dado que la mayoría de los pacientes con cáncer de páncreas ya tienen un diagnóstico de enfermedad metastásica, con opciones de tratamiento limitadas. Los resultados destacan el potencial del uso de derivados de cannabis no cannabinoides / no psicoactivos para dicho tratamiento. Un trabajo adicional para optimizar la eficacia terapéutica para tales derivados de cannabis y evaluar la toxicidad podría establecer el escenario para la traducción clínica. Una ventaja del enfoque SRB aquí también es que esto podría minimizar cualquier toxicidad debido al suministro in situ y al uso de inmunoadyuvante menos múltiple. Además, el uso de una dosis única de RT como se hizo en este proyecto minimizaría la toxicidad normal del tejido.
Aunque la Figura 4 no muestra una diferencia significativa entre el uso de SRB solo versus SRB con RT, los SRB simplemente podrían usarse como marcadores fiduciales (23) (Figura 1) que ofrecen una vía viable para la traducción clínica sin ningún inconveniente adicional para los pacientes. Otra ventaja del uso de SRB para la entrega in situ sostenida de cargas útiles es la relativa conveniencia de administrar los inmunoadyuvantes, en comparación con las inyecciones repetidas. Usar solo una fracción de RT también sería más conveniente para los pacientes con cáncer que generalmente deben venir repetidamente durante muchas semanas para recibir tratamiento con varias fracciones de radioterapia. Esto debería reducir significativamente el tiempo y los costos del tratamiento. Sería un beneficio en entornos de escasos recursos donde el acceso a los servicios de RT es limitado, reduciendo las disparidades en la salud del cáncer, con un gran impacto en la salud global.
Si bien los resultados indican que la exposición sostenida de las células tumorales a FBL-03G puede aumentar la destrucción de células tumorales locales y metastásicas, el mecanismo de dicha acción debe investigarse más a fondo. Una hipótesis es que FBL-03G puede servir como un agente de inmunoterapia, inhibiendo el crecimiento de tumores localmente tratados y no tratados, representando metástasis. La metástasis representa la mayoría de todos los sufrimientos y muertes asociados con el cáncer, y presenta un desafío cuestionable en el manejo del cáncer. En adelante, el aumento significativo observado en la supervivencia es prometedor, especialmente para el cáncer de páncreas que a menudo es recalcitrante a los tratamientos. Otra hipótesis es que el parto sostenido también permite que FBL-03G llegue al tumor no tratado durante un período prolongado. De cualquier manera, los resultados del FBL-03G revelan un nuevo derivado potencial del cannabis no cannabinoide con un gran potencial para su consideración en futuras investigaciones en el tratamiento del cáncer de páncreas, donde se necesitan urgentemente nuevas opciones de terapia.
Conclusión
En este estudio, un derivado flavonoide del cannabis demuestra un potencial terapéutico significativo en el tratamiento del cáncer de páncreas, incluido el potencial de tratamiento de metástasis por radio sensibilización y cáncer. Los resultados justifican más estudios para optimizar los resultados de la terapia hacia la traducción clínica.
Disponibilidad de datos
Todos los conjuntos de datos generados para este estudio se incluyen en el manuscrito y / o en los archivos complementarios.
Declaración de Ética
Los experimentos con animales y el protocolo siguieron las pautas y regulaciones establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto del Cáncer Dana-Farber (IACUC). El mantenimiento de los ratones en las instalaciones para animales del Instituto del Cáncer Dana Farber se realizó de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
